精子分离的基本原理

意识到人类精子在分离过程中易受氧化应激的损害很重要。由于精子富含氧化应激攻击的靶点，尤其是精子中的多元不饱和脂肪酸(精子中50%的脂肪酸是含有六个双键的二十二碳六烯酸)和DNA，更容易受到损伤。这种高度特异化的精子的弱点还有体积小、细胞质空间有限，不像在体细胞中含有重要的抗氧化酶如:过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶等(1.4)。由于这种固有的弱点，精子高度依赖于能提供抗氧化保护的细胞外液，也正是因为这个原因，男性精浆已经演化成最强的抗氧化性液体之一。

精浆的抗氧化保护作用很重要,因为在射精的那一刻精子就可能接触白细胞，虽然白细胞来源仍有争议，但多数人认为是从尿道或附属性腺进入精浆中。每份精液中都含白细胞,要为中性粒细胞和巨噬细胞，它们都会产生活性氧(reactive oxygen specie ROS) 。因此，处理精子的方法应尽量避免精子离开精浆后与白细胞接触。为此，直接将精子从精浆中分离出来的精子制备技术中，采用不连续梯度离心法、精液上游法或电泳法处理精子，比反复离心洗涤法和沉淀上游法，更易获得高活力、功能好的精子;这是因为采用后者处理精子时，失去了精浆抗氧化的保护，精子瞬间受到精液中白细胞产生的自由基攻击所致。而且，有些培养液如 Hams F10中含有过渡金属，如铁能促进精子脂质过氧化作用，使氧化应激加剧，进而对精子的功能造成严重的损伤

通过Percol1梯度离心法或精浆上游法直接分离出来的精子，仍可能被白细胞污染对ART的精液处理过程白细胞污染情况进行详细研究发现，约30%的精液处理时仍有白细胞污染。而且，样本中白细胞的污染水平与IVF受精率呈负相关圆。

即使采用了上述推荐的精子处理方法，白细胞污染仍然避免不了，主要有三种处理方法:

1)通过甲酰肽或酵母聚糖处理标本后，采用简单、敏感的化学发光法检测白细胞污染。如果检测到污染，则可以用抗CD45(白细胞的共同抗原)抗体的磁珠将白细胞去除13]。

2)培养液中加入抗氧化剂抵消白细胞污染带来的负面影响。如:谷胱甘肽、N-乙酰半胱氨酸、连二亚硫酸、过氧化氢酶等可以在体外发挥抗氧化保护作用91

3)在培养液中补充EDTA、DETAPAC或脱铁运铁蛋白等试剂能螯合具有细胞毒性的过渡金属，中和ROS对脂质过氧化的刺激作用。

DNA 损伤

以前，在处理精子时只关注精子的受精能力，现在我们知道精子另一个重要作用是赋予胚胎正常发育的能力。在这一方面，精子起了重要的作用，包括:

①提供一个调节胚胎细胞分裂的中心粒;

②染色质重塑,表现为鱼精蛋白1和2的比例为1:1，组蛋白的含量也相应地发生了改变;

③受精精子带入卵中的mRNA和miRNA可能参与调节早期胚胎发育;

④适当的DNA甲基化;

⑤细胞核DNA完整性。

精子的DNA完整性是精子质量的最重要部分。精子DNA损伤与许多不良的临床结局相关，包括:受精失败、植入前胚胎发育停滞、流产风险增加以及各种各样的子代缺陷如复杂的神经调控缺陷如自闭症、自发精神分裂症，甚至儿童癌症等。

与自然怀孕的人群相比，男性的精子DNA损伤可能导致ART中出生缺陷的增多尚缺乏明确定论。有证据显示，助孕出生的小孩基因印记异常疾病增加，尤其是Beckwith Wiedemann和Angelman综合征，可能与精子甲基化状态缺陷有关。还有资料表明，与自然妊娠的新生儿相比，ART出生的单胎新生儿入新生儿重症监护病房、住院的比例明显增多，并且住院时间增长。最近有独立研究表明，ICSI后出生的男孩睾丸未下降的发生率增加了8倍，而且还有视网膜血管生成异常病例报道。为了避免这种男性因素造成子代的出生缺陷，在实施助孕的精子处理时，不仅要保证分离到的精子受精能力好，而且要保证精子DNA尽量不受任何损伤。

鉴于精子处理技术影响了精子DNA的完整性，有必要强调的是我们已知的精子DNA的损伤，如氧化应激导致精子功能缺失。这种损伤也与精子发生过程中染色质重塑缺陷有关。据此，我们提出了造成精子DNA损伤的“两步假说”。第一步是精子发生异常导致生成的精子存在染色质重塑缺陷，鱼精蛋白缺失。第二步是这种脆弱的细胞受到氧化攻击后导致碱基聚合物迅速形成，尤其是8-羟基-2-脱氧鸟苷。这种聚合物可以破坏DNA主链，形成脱碱基位点，最终造成DNA断裂。

因此，无论我们采用何种方法制备ART所用的精子，都必须避免产生 DNA氧化损伤。许多研究表明，如不连续密度梯度离心分离精子过程可造成轻微的DNA 损伤。虽然这是个阳性结果，值得注意的是用TUNEL 或卫星试验方法检测的DNA完整性时，并没有考虑到细胞活力。最新的研究进展是采用流式细胞术的方法，首次同时检测了精子的DNA 损伤和精子活力。通过这一技术清楚地证明了来自射精的精液中发生 DNA损伤的精子，绝大多数为死精子。该研究也证实了以往报道，表明不连续梯度离心法处理精液与其他方法相比，能获得活力更高且 DNA 损伤更少的精子。当只检测活精子时，则发现该方法处理后活精子氧化损伤明显增加，表现为DNA碎片水平显著升高。因此，尽管我们应用ART精子制备技术分离精子时已经非常小心，DNA损伤仍会发生，显然仍需要探索新的精子处理技术。

电泳法分离精子

2005年Ainsworth等改良一种用于助孕治疗的精子分离技术。其操作原理有以下两点:

①功能正常的精子带负电,在电场中向阳极移动;

②精子是体内最小的细胞，可以通过5微米的滤网。

文献中描述的电泳设备是利用电流推动带负电荷的精子通过聚碳酸酯滤网，泳向收集小室，详如图231所示。该设备为盒式电泳，插入了两个400ul的小室，中间间隔一层孔径为5μm的聚碳酸酯滤网，四周为15kDa聚丙烯酰胺膜，以保证缓冲液的循环。精液加在一侧小室，在75mA电流、可变电压的作用下，几秒钟内即可在另一侧小室获得高质量的精子悬液。

这种方法能迅速的分离精子，且得到的精子具有良好的活动力，极好的形态，DNA损伤率低的特点，而且基本没有白细胞和前体生殖细胞的污染。该方法也适用于其他来源的样本，包括睾丸活检和冷冻精子的分离。

在这一最初的研究结果基础上，研究者利用这套分离系统处理了一例由于高DNA损伤率而导致长期不孕患者丈夫的精子。该病例的男性为少精症患者，取卵当天精子密度为3.2x10/ml，圆形细胞浓度2.1x106/ml活率为30%，活力18%，精子凋亡检测 TUNEL 阳性率26%。通过电泳分离精子后，精子活率为62%，活力为24%，TUNEL 阳性率为14%。采用SCSA分析结果显示DNA碎片指数由处理前41%降至处理后15%。将电泳处理后的精子用于ICSI授精。7个卵中有5个受精，受精第三天移植2个胚胎，成功妊娠并诞生一健康女婴。

这病例报道后，又有许多更深入的临床研究比较电泳法与传统密度梯度离心法的效果。每份精液均同时用上述两种方法处理，同一患者卵子随机分成两组，随机加入两种方法处理后的精子授精，最后对精子收获率、活动力、DNA碎片等进行比较。发现这两种方法的受精率(62.4%vs63.6%)、卵裂率(99.0%vs88.5%)、优质胚胎率(27.4% vs26.1%)均无显著性差别。因此，这种新的精液处理方法与密度梯度离心法等效，但花费时间少。